основе своей остается морфологической наукой со своим набором методов.

Последние позволяют охарактеризовать процессы, происходящие в клетках и тканях, их структурные особенности.

Главными этапами цитологического и гистологического анализа являются выбор объекта исследования, подготовка его для изучения в микроскопе, применение методов микроскопиропания, качественный и количественный анализ изображений.

Объектами исследования служат живые и фиксированные клетки и ткани, их изображения, полученные в световых и электронных микроскопах или на телевизионном экране дисплея. Существует ряд методов, позволяющих проводить анализ указанных объектов.

Основными методами изучения биологических микрообъектов являются световая и электронная микроскопия, которые широко используются в экспериментальной и клинической практике.

Микроскопирование — основной метод изучения микрообъектов, используемый в биологии более 300 лет. С момента создания и применения первых микроскопов они постоянно совершенствовались. Современные микроскопы представляют собой разнообразные сложные оптические системы, обладающие высокой разрешающей способностью. Размер самой

маленькой структуры, которую можно видеть в микроскопе, определяется наименьшим разрешаемым расстоянием (с10), которое в основном зависит от длины волны света (*.) и длины волн электромагнитных колебаний потока электронов и др.  Таким образом, чем меньше длина волны, тем меньше разрешаемое расстояние и тем меньшие по размерам микроструктуры

можно видеть в препарате. Для изучения гистологических препаратов применяют разнообразные виды световых микроскопов и электронные микроскопы.

Световая микроскопия. Для изучения гистологических микрообъектов применяют обычные световые микроскопы и их разновидности, в которых используются источники света с различными длинами волн. В обычных световых микроскопах источником освещения служит естественный или искусственный свет. Минимальная длина волны видимой части

спектра равна примерно 0,4 мкм. Следовательно, для обычного светового микроскопа наименьшее разрешаемое расстояние равно приблизительно 0,2 мкм (с10 " '/,• 0.4 мкм ■ 0,2 мкм), а общее увеличение (произведение увеличения объектива на увеличение окуляра) может быть 1500—2500.

Таким образом, в световом микроскопе можно видеть не только отдельные клетки размером от 4 до 150 мкм, но и их внутриклеточные структуры — органеллы, включения. Для усиления контрастности микрообъектов применяют их окрашивание.

Ультрафиолетовая микроскопия. Эго разновидность световой микроскопии. В ультрафиолетовом микроскопе используют более короткие ультрафиолетовые лучи с длиной волны около 0,2 мкм. Разрешаемое расстояние здесь в 2 раза меньше, чем в обычных световых микроскопах, и составляет приблизительно 0.1 мкм (<10 " 0,2 мкм = 0,1 мкм). Полученное в ультрафи-

олетовых лучах невидимое глазом изображение преобразуется в видимое с помощью регистрации на фотопластинке или путем применения специальных устройств (люминесцентный экран, электронно-оптический преобразователь).

Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия. Явления флюоресценции заключаются в том. что атомы и молекулы ряда веществ, поглощая коротковолновые лучи, переходят в возбужденное состояние. Обратный переход из возбужденного состояния в нормальное происходит с испусканием света, но с большей длиной волны. В флюоресцентном микроскопе в

качестве источников света для возбуждения флюоресценции применяют ртутные или кссноновые лампы сверхвысокого давчеиия, обладающие высокой яркостью в области спектра 0,25—0,4 мкм (ближние ультрафиолетовые лучи) и 0,4—0,5 мкм (сине-фиолетовые лучи). Длина световой волны флюоресценции всегда больше длины волны возбуждающего свега, поэто-

му их разделяют с помощью светофильтров и изучают изображение объекта только в свете флюоресценции. Различают собственную, или первичную. и наведенную, или вторичну ю, флюоресценцию. Любая клетка живого организма обладает собственной флюоресценцией, однако она часто бывает чрезвычайно слабой.

Первичной флюоресценцией обладают серотонин, катехоламины (адреналин, норадрсналин), содержащиеся в нервных, тучных и других клетках, после фиксации тканей в парах формальдегида при 60—80 *С (метод Фалька).

Вторичная флюоресценция возникает при обработке препаратов специальными красителями — флюорохромам и.

Существуют различные флюорохромы, которые специфически связываются с определенными макромолекулами (акридин оранжевый, родамин, флюоресцеин и др.). Например, при обработке препаратов чаше всего употребляется флюорохром акридиновый оранжевый. В этом случае ДНК и ее соединения в клетках имеют ярко-зеленое, а РНК и ее производные —

ярко-красное свечение. Таким образом, спектральный состав излучения несет информацию о внутреннем строении объекта и его химическом составе. Вариант метода фтюорссцситной микроскопии, при котором и возбуждение, и излучение флюоресценции происходят в ультрафиолетовой области спектра, получил название метода ультрафиолетовой флюоресцент-

ной микроскопии, Фаюво-контрастная микроскопия. Этот метод служит для получения контрастных изображений прозрачных и бесцветных живых объектов, невидимых при обычных методах микроскопирования. Как уже указывалось, в обычном световом микроскопе необходимая контрастность структур достигается с помощью окрашивания. Метод фазового контраста обеспечивает

контрастность изучаемых неокрашенных структур за счет специальной кольцевой диафрагмы, помещаемой в конденсоре, и так называемой фазовой пластинки, находящейся в объективе. Такая конструкция оптики микроскопа даст возможность преобразовать не воспринимаемые глазом фазовые изменения прошедшего через неокрашенный препарат света н изменение

его амплитуды, т.е. яркости получаемого изображения. Повышение контраста позволяет видеть все структуры, различающиеся по показателю преломления. Разновидностью метода фазового контраста является метод фазоеотемнопольного контраста, дающий негативное по сравнению с позитивным фазовым контрастом изображение.

Микроскопия в темном поле. В темнопольном микроскопе только свет, который даст дифракцию структур в препарате, достигает объектива. Происходит это благодаря наличию в микроскопе специального конденсора,

который освещает препарат строго косым светом; лучи от осветителя направляются сбоку. Таким образом, поле выглядит темным, а мелкие частицы в препарате отражают свет, который далее попадает в объектив. Разрешение этого микроскопа не может быть лучше, чем у светлопольного микроскопа, так как используется такая же длина волны. Но здесь достигается

больший контраст. Он используется для изучения живых объектов, авторадиографических объектов, например зерен серебра, которые выглядят светлыми на темном поле. В клинике его применяют для изучения кристаллов в моче (мочевая кислота, оксалаты), для демонстрации спирохет, в частности (гсропста раШ(1ит, вызывающей сифилис и др.

Интерференционная микроскопия. Разновидностями фазово-контрастного микроскопа являются интерференционный микроскоп, который предназначен для количественного определения массы ткани, и дифференциальный интерференционный микроскоп (с оптикой Номарского), который специально используют для изучения рельефа поверхности клеток и других биологических объектов.

В интерференционном микроскопе пучок света от осветителя разделяется на два потока: один проходит через обьект и изменяет по фазе колебания, второй идет, минуя объект. В призмах обьсктива оба пучка соединяются и интерферируют между собой. В результате строится изображение, в котором участки микрообъекта разной толщины и плотности рапичаются

по степени контрастности. Проведя количественную оценку изменений, определяют концентрацию и массу сухого вещества.

Фазово-контрастный и интерференционный микроскопы позволяют изучать живые клетки. В них используется эффект интерференции, возникающий при комбинации двух наборов волн, который создает изображение микроструктур. Преимуществом фазово-контрастной, интерференционной и темнопольной микроскопии является возможность наблюдать клетки в процессе движения и митоза. При этом регистрация движения клеток может производиться с помощью цейтраферной (покадровой) микрокиносъсмки.

Поляризационная микроскопия. Поляризационный микроскоп является модификацией светового микроскопа, в котором установлены два поляризационных фильтра — первый (поляризатор) между пучком света, и объектом, а второй (ан&тизатор) между линзой объектива и глазом. Через первый фильтр свет проходит только в одном направлении, второй фильтр

имеет главную ось, которая располагается перпендикулярно первому фильтру, и он не пропускает свет. Получается эффект темного поля. Оба фильтра могут вращаться, изменяя направление пучка свста. Если анализатор повернуть на 90" по отношению к поляризатору, то свет проходить через них не будет. Структуры, содержащие продольно ориентированные молеку-

лы (коллаген, микротрубочки, микрофиламенты), и кристаллические структуры (в клетках Лейлига1) при изменении оси вращения проявляются как светящиеся. Способность кристаллов или паракристаллических образований к раздвоению световой волны на обыкновенную и перпендикулярную к ней называется двойным лучепреломлением. Такой способностью об-

ладают фибриллы поперечнополосатых мышц.

Электронная микроскопия. Большим шагом вперед в развитии техники микроскопии были создание и применение электронного микроскопа. В электронном микроскопе используется поток хтектронов с более короткими, чем в с истовом микроскопе, длинами волн. При напряжении $0 000 В шина волны электромагнитных колебаний, возникающих при

движении потока электронов в вакууме, равна 0,0056 нм. Теоретически рассчитано, что разрешаемое расстояние в этих условиях может быть около 0,002 нм, или 0,000002 мкм, т е. в 100 000 раз меньше,'чем в световом микроскопе. Практически в современных электронных микроскопах разрешаемое расстояние составляет около 0,1—0,7 нм.

В настоящее время широко используются трансмиссионные (просвечивающие) электронные микроскопы (ТЭМ) и ска-

нирующие (растровые) электронные микроскопы (СЭМ).

С помощью ТЭМ можно получить лишь плоскостное изображение изучаемого микрообъекта. Для получения пространственного представления о структурах применяют СЭМ, способные создавать трехмерное изображение.

Растровый электронный микроскоп работает по принципу сканирования электронным микрозондом исследуемого объекта, т. с. последовательно «ощупывает* остро сфокусированным электронным пучком отдельные точки поверхности. Для исследования выбранного участка микрозонд двигается по его поверхности под действием отклоняющих катушек (принцип телевизионной развертки). Такое исследование объекта называется сканированием (считыванием), а рисунок, по которому движется микрозонд, —растром. Полученное изображение выводится на телевизионный экран, электронный луч которого движется синхронно с микрозондом.

Главными достоинствами растровой электронной микроскопии являются большая глубина резкости, широкий диапазон непрерывного изменения увеличения (от десятков до десятков тысяч раз) и высокая разрешающая способность.

Электронная микроскопия по методу замораживания — ска-швания применяется для изучения деталей строения мембран и межклеточных соединений Для изготовления сколов клетки замораживают при низкой температуре (—160 ®С). При иссле-

довании мембраны плоскость скола проходит через середину бислоя липидов. Далее на внутренние поверхности полученных половинок мембран напыляют металлы (платина, палладий, уран), изучают их с помощью ТЭМ и микрофотографии

Метод криозлектронной микроскопии Быстро замороженный тонкий слой (около 100 нм) образца ткани помешают на микроскопическую решепсу и исследуют в вакууме микроскопа при -160 "С.

Метод к трон ной микроскопии »ишораживание — травление применяют для изучения внешней поверхности мембран клеток После быстрого замораживания клеток при очень низкой температуре блок раскалывают лезвием ножа. Образующие-

ся кристаллы льда удаляют путем возгонки воды в вакууме. Затем участки клеток оттеняют, напыляя гонкую пленку тяжелого металла (например, платины). Метод позволяет выявлять трехмерную организацию структур Гланлулоциты яичка.

 Таким образом, методы замораживания — скалывании и замораживания —травления позволяют изучать нефиксированные клетки без образования н них артефактов. вызываемых фиксацией.

Методы контрастирования солями тяжелых металлов позволяют исследовать в электронном микроскопе отдельные макромолекулы — ДНК, крупных белков (например, миозин) При негативном контрастировании изучают агрегаты

макромолекул (рибосомы, вирусы) либо белковые филаменты (актиновые нити) Электронная микроскопам ультратонких срезов, полученных методом криоулыпромикротииии При этом методе кусочки тканей без фиксации и заливки в твердые

среды быстро охлаждают в жидком азоте при температуре -196 "С Это обеспсчивает торможение метаболических процессов меток и переход »оды из жилкой фазы в твердую Далее блоки режут на ульграмикротоме при низкой температуре. Такой

метод приготовления срезов обычно используют для определения активности ферментов. а также для проведения иммуиохимичсских реакций Для выявления антигенов применяют антитела, связанные с частицами коллоидного золота, локализацию которого легко выявить на препаратах.

Методы сверхвысоковольтной микроскопии Используют -электронные микроскопы с ускоряющим напряжением до 3 ООО ООО В Преимущество этих микроскопов в том. что они позволяют исследовать объекты большой толщины (1 — 10 мкм). так

как при высокой энергии элскгронов они меньше поглощаются объектом Стереоскопическая съемка позволяет получать информацию о трехмерной организации внутриклеточных структур с высоким разрешением (около 0,$ нм).

Рентгеноструктурный анализ Для изучения структуры макромолекул на атомарном уровне применяют методы с использованием рентгеновских лучей, имеющих длину ва1ны около 0,1 нм (диамегр атома водорода). Молекулы, образующие крис-

таллическую решетку, изучают с помощью дифракционных картин, которые регистрируют на фотопластинке в виде множества пятен различной интенсивности Интенсивность пятен зависит от способности рагличных объектов в решетке рассеивать

излучение Положение пятен в дифракционной картине зависит от положения объекта в системе, а их интенсивность свидетельствует о его внутренней атомной структуре.